RAW264.7 makrofajlarında lipotoksik endoplazmik retikulum stres sürecinde ifadesi değişen mikroRNAların tanımlanması

Abstract

Amaç: Kan dolaşımındaki serbest yağ asitlerinin artışı ve adipoz olmayan dokulardaki birikimi, insülin direnci, diyabet ve ateroskleroz gibi obezite ile ilişkili metabolik ve emflamatuvar hastalıkların gelişiminde önemli rol oynar. Yağ dokusu, fazla olan yağ asidini depolayabilme kabiliyetine sahipken, diğer dokulara ulaşan fazla miktarda yağ asidi, endoplazmik retikulum (ER) ve mitokondri gibi intraselüler metabolik organelleri zorlayarak stres cevabının oluşmasına ve lipotoksik hücre ölümüne neden olur. Katlanmamış protein yanıtı (KPY) endoplazmik retikulumun strese karşı önemli bir adaptasyonudur. Lipidler ile KPY arasındaki ilişkinin nasıl olduğu ve katlanmamış protein yanıtı ile adaptif ve destrüktif sonuçların nasıl yönetildiği halen tam olarak aydınlatılamamıştır. miRNA biyogenezinde KPY'nın rolünün yanı sıra, katlanmamış protein yanıtını düzenleyen miRNAların önemine işaret eden kanıtlar bulunmaktadır. Bu çalışmada lipidler ile KPY arasındaki ilişkiyi anlamak için, makrofajlardaki lipotoksik ER stresi sürecinde düzenlenen mikroRNA'ların tanımlanması amaçlanmıştır.Metod: Fare makrofaj hücre hattına (RAW 264.7), serbest yağ asidi olan 500 µM palmitat -obez hastaların kan dolaşımındaki seviyede- uygulanarak stres oluşturulmuştur. miRBase sürüm 16'daki bilinen tüm fare mikroRNAlarını içeren QRT-PCR temelli miSCRİPT miRNA PCR array sistemi kullanılarak, hücrelerdeki tüm mikroRNAom profili analiz edilmiş ve potansiyel hedefler için yolak analizleri gerçekleştirilmiştir.Bulgular: Lipotoksik ER stres sonucu, 227 mikroRNA'nın ifade seviyesi 2 kat üzerinde değişmiş ve 43'ü 2 kattan fazla,13'ü ise 3-24 kat değişim göstermiştir. Yolak analizi gerçekleştirilerek lipotoksik ER stresi ile ilişkili mikroRNA'ların mRNA hedefleri belirlenmiş ve gruplanmıştır.Sonuç: Makrofajlar, ER stresini indükleyebilen yüksek konsantrasyondaki doymuş yağ asidine maruz bırakıldığında mikroRNAome profillerinde dinamik bir değişim gözlenmektedir. Bulgularımız, obezitedeki doku ilişkili makrofajlar ve kan dolaşımındaki monositlerdeki lipotoksik stres sonuçlarını yansıtmaktadır. Detaylı çalışmalar gerçekleştirilerek, lipotoksik ER stresi sürecinde ifadesinin değiştiğini rapor ettiğimiz mikroRNA değişimlerinden hangi KPY yolağının sorumlu olduğu belirlenebilir. Objective: Increased fatty acids in the circulation and their accumulation in non-adipose tissues play a significant role in the development of obesity related metabolic and inflammatory disorders such as insulin resistance, diabetes and atherosclerosis. While fat tissue has the ability to store excess fatty acids, uptake of excess fatty acids to other tissues burdens intracellular metabolic organelles such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), leading to stress response and lipotoxic cell death. Unfolded protein response (UPR) is a key adaptation of the ER to stress. It is still not completely clear how lipids engage the UPR and how UPR manages both the adaptive and destructive consequences under its control. Increasing evidence point to the importance of miRNA regulation of the UPR as well as UPR's role in miRNA biogenesis. In order to understand how lipids engage the UPR, we set forth to identify microRNAs regulated by lipotoxic ER stress in macrophages.Methods: We stressed the mouse macrophage cell line (RAW 264.7) with a saturated fatty acid, 500µM palmitate, reflecting the levels found in the circulation of obese patients. We analyzed the microRNAome profiles of this cell line using QRT-PCR based miScript miRNA PCR array which contained all known mouse microRNAs in miRBase release16 and performed pathway analysis for potential targets.Results: 227 microRNAs showed altered expression levels; 43 microRNAs above 2 fold difference and 13 microRNAs 3-24 fold difference. Pathway analysis enriched the target mRNAs of these lipotoxic ER stress associated miRNAs. Conclusion: When exposed to high concentrations of saturated fatty acids that can induce ER stress, macrophages display a dynamic range of changes in their microRNAome profiles. Our findings reflect the consequences of lipotoxic stress on circulating monocytes and tissue-associated macrophages in obesity. Further studies are needed to deliniate which UPR arm is reponsible for the microRNA changes reported here.